培養(yǎng)液按說(shuō)明書講是要避光的，但從4攝氏度冰箱拿出來(lái)一起照臺(tái)，剛好溫度升上去，而且紫外線不透塑料，所以就拿去照吧。胰酶也說(shuō)要4攝氏度保存，但同樣存在一個(gè)升溫的問(wèn)題，尤其是胰酶的消化溫度，所以也拿去照臺(tái)。

通用型4℃冰箱推薦：澳柯瑪實(shí)驗(yàn)室通用4℃冰箱，出廠預(yù)設(shè)4攝氏度，誤差正負(fù)0.1℃，具有控溫報(bào)警系統(tǒng)，整層擱板設(shè)計(jì)。

細(xì)胞就不要拿去照臺(tái)了，也不噴酒精，以免倒置顯微鏡下看不清楚，沾濕的瓶口也更容易沾上臟東西。照臺(tái)前，先往超凈臺(tái)噴一遍酒精，放完物品可以再噴一次。照完臺(tái)，關(guān)紫外燈，開(kāi)白燈，開(kāi)風(fēng)機(jī)，ZUI低檔風(fēng)速即可，戴上手套，手套噴酒精，操作前，先點(diǎn)酒精燈，再用酒精紗布擦擦臺(tái)面，擦完的干凈臺(tái)面上可以放瓶蓋，瓶蓋凹面不能向上，側(cè)放，不行的話就將瓶蓋蓋在干凈的臺(tái)面上。開(kāi)小培養(yǎng)瓶的瓶蓋，可以手掌小魚際固定、壓住平放的培養(yǎng)瓶瓶身，拇指和食指擰開(kāi)瓶蓋，達(dá)到單手操作的效果，擰上的時(shí)候也一樣。

滴管不用的時(shí)候夾在無(wú)名指和中指之間，保持水平，避免污染。開(kāi)蓋后的培養(yǎng)瓶，不要豎立，往培養(yǎng)瓶中加液體時(shí)拿著培養(yǎng)瓶也是斜放。滴管的液體盡量避免沾到瓶口，因?yàn)檠宓拇嬖谒?培養(yǎng)基會(huì)產(chǎn)生氣泡，滴管不要排空就不會(huì)把滴管內(nèi)的氣泡帶入培養(yǎng)瓶或沾在滴管口，滴管口不沾氣泡則在出瓶口時(shí)不容易沾到瓶口。滴管出瓶口的時(shí)候，要快進(jìn)快出，要懸著一個(gè)念頭，念頭懸著進(jìn)而注意力更集中、動(dòng)作更快。

低速離心機(jī)：細(xì)胞離心應(yīng)選擇較低的轉(zhuǎn)速，避免對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷，個(gè)人習(xí)慣用1000r/min，一般離心5分鐘。差速離心技術(shù)的應(yīng)用十分普遍，尤其是針對(duì)有生物活性的物質(zhì)，如動(dòng)植物病毒、各種亞細(xì)胞組分(細(xì)胞核、葉綠體、線粒體等)，以及核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的分離、粗提和濃縮。

復(fù)蘇：先讓水浴鍋的溫度達(dá)到37攝氏度左右，從低溫區(qū)取出凍存的細(xì)胞后馬上投入水浴中。復(fù)蘇的關(guān)鍵是快速解凍。將凍存的細(xì)胞吸到離心管中，加入一定量*培養(yǎng)液后離心，是為了去除凍存液中的DMSO。直接吸取1ml凍存液到25平方厘米的培養(yǎng)瓶中，再加*培養(yǎng)基到5ml，則DMSO的終濃度為2%，這個(gè)濃度的DMSO還是會(huì)在一定程度上抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。不經(jīng)過(guò)離心去除DMSO，不是說(shuō)一定不可以，只是后果自負(fù)。

換液：當(dāng)培養(yǎng)液變黃時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，一定要換液，快長(zhǎng)滿了就傳代或凍存。當(dāng)培養(yǎng)液較臟時(shí)，比如漂浮較多死細(xì)胞，一般出現(xiàn)在復(fù)蘇或傳代后的第二天、以及常規(guī)生長(zhǎng)細(xì)胞的第二三天，也要及時(shí)換液。

洗細(xì)胞：當(dāng)培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)較多死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或其他雜質(zhì)時(shí)，就要清洗一下。但注意用吸管加入PBS或生理鹽水時(shí)，要對(duì)著培養(yǎng)瓶側(cè)壁，以免沖刷掉瓶底的部分細(xì)胞。加入PBS或生理鹽水后，蓋上蓋子，在臺(tái)面上搖晃幾下，注意不要把液體濺起來(lái)或沾到培養(yǎng)瓶頂面。能用PBS洗較好，雖然PBS的主要成分是氯化鈉，但具有pH緩沖作用，用無(wú)菌生理鹽水洗細(xì)胞也可，優(yōu)點(diǎn)是比較便宜。

消化：個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是先摸時(shí)間，一勞永逸，以后對(duì)于同一種細(xì)胞到時(shí)間了就趕緊加*培養(yǎng)基終止消化。一般消化2分鐘就行了，在此基礎(chǔ)上增減消化的時(shí)間。也有人建議在倒置顯微鏡下觀察，等大部分貼壁細(xì)胞收縮后就停止消化，但個(gè)人認(rèn)為這是多此一舉，而且很難把握一個(gè)度。吹打細(xì)胞要有節(jié)奏，動(dòng)作要熟練，吸的時(shí)候要在液面下吸，吹的時(shí)候要對(duì)著瓶底沒(méi)液平的地方吹，吸的時(shí)候不要吸到氣體、吹的時(shí)候不要吹入液體平面下，這樣就基本不會(huì)產(chǎn)生氣泡。

傳代：常用1:2傳代，這樣才有足夠的細(xì)胞密度。不離心再重懸細(xì)胞，雖然避免了離心和重懸對(duì)細(xì)胞的損傷，減少了幾個(gè)步驟，減少污染，但吸掉胰酶的中和液后很容易丟失一部分細(xì)胞，甚至丟失大部分細(xì)胞，對(duì)于初學(xué)者不太適用。剛傳代的細(xì)胞，若在倒置顯微鏡下觀察到分布不均勻、有細(xì)胞團(tuán)，就要及時(shí)晃勻。